Rozdíly ve zranitelnosti vůči vysušujícímu stresu mezi epitelem rohovky a spojivky u králičích modelů krátkodobé expozice povrchu oka

Králičí model krátkodobé expozice keratopatie

V této studii byli použiti novozélandští bílí králíci (hmotnost 2,0‒2,2 kg). Studie byla provedena v souladu s pokyny ARRIVE. Všechny postupy se řídily prohlášením Asociace pro výzkum zraku a oftalmologie (ARVO) pro použití zvířat v očním a zrakovém výzkumu (ARVO Animal Policy). Schválení pro tuto studii bylo získáno od institucionálního kontrolního výboru korejské univerzity Guro Hospital, Soul, Jižní Korea (KOREA-2021-0122).

Všechny experimentální postupy in vivo (včetně barvení očního povrchu, odběru vzorku slz a otiskové cytologie) byly prováděny v celkové anestezii vyvolané intramuskulární injekcí hydrochloridu ketaminu (35 mg/kg) a hydrochloridu xylazinu (5 mg/kg).50. Pravé oči králíků byly použity pro všechny experimenty a levé oči byly ponechány bez ošetření a byly použity jako kontroly. Interpalpebrální štěrbiny byly ponechány široce otevřené po dobu 30 minut, aby byla zajištěna expozice centrální rohovky, limbu a periilimbální spojivky, přičemž mrkání bylo prováděno ručně jednou za minutu. Oči byly hodnoceny v každém časovém bodě: 3 minuty, 10 minut, 20 minut a 30 minut.

Barvení povrchu oka a hyperémie spojivek

Rohovka a spojivka králíků byly vyšetřeny pod přenosným mikroskopem se štěrbinovou lampou s kobaltově modrým filtrem v celkové anestezii po nakapání 1 kapky 1% roztoku fluoresceinu. K podrobnému hodnocení barvení spojivky byl použit žlutý filtr. Pro skóre barvení rohovky fluoresceinem (CFS) byly papírové proužky impregnované fluoresceinem sodným (Haag-Streit, Bern, Švýcarsko) aplikovány na horní bulbární povrch po zatažení horního víčka a po navlhčení konce proužku 5 μl fyziologického roztoku.

Skóre očního barvení bylo hodnoceno jediným zkušeným oftalmologem podle standardního systému hodnocení National Eye Institute (NEI). tečkovité barvení fluoresceinem v každé oblasti bylo hodnoceno na stupnici od 0 do 3 a celkové skóre (0-15) je součtem skóre pro všech pět oblastí. Spojivka byla rozdělena do šesti oblastí a celkové skóre (0–18) je součtem skóre všech šesti oblastí4. Konjunktivální hyperémie byla hodnocena pomocí Efronovy škály pro zarudnutí spojivky, která se skládá z pěti stupňů (0–4).51.

Odběr vzorku slz a enzymatický imunosorbentní test

Vzorky slz byly odebrány ze základní linie králičích očí a po 3, 10, 20 a 30 minutách expozice spojivky a rohovky. Šedesát mikrolitrů normálního fyziologického roztoku bylo jemně aplikováno na dolní fornix pomocí mikropipety, dvakrát. Poté byl opatrně odebrán celkový objem 120 μl vzorku slz52. Vzorky slz byly použity k měření hladin MUC5AC, ke zkoumání sekrece mucinu spojivkových pohárkových buněk do slz. Hladina MUC5AC ve vzorku slz byla hodnocena pomocí enzymové imunosorbentní soupravy pro králičí MUC5AC (MyBiosource, San Diego, CA, USA). Všechna měření byla prováděna podle protokolu výrobce za použití mikrodestičkového spektrofotometru (Spectramax Plus® 384; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Impresní cytologie a analýza western blot

Po odebrání posledního vzorku slz po 30 minutách expozice oka byla provedena otisková cytologie rohovky a spojivky. Po nakapání 0,5% očních kapek hydrochloridu proparakainu (Alcaine®, Bausch & Lomb, Rochester, NY, USA). Na rohovku a spojivku byla aplikována nitrocelulózová membrána o průměru 8 mm (Millipore, Bedford, MA, USA). Membrána byla poté jemně sloupnuta hladkými kleštěmi. Membrána byla okamžitě ponořena do jamky, která byla naplněna fixačním roztokem. K histologickému barvení membrány ve vzorku bylo použito barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) a kyselinou jodistou – Schiff (PAS)53.

Extrakty tkáňových buněk z otiskové cytologie rohovky byly podrobeny analýze western blot pro měření hladin proteinu AQP5. Ty z konjunktivální impresní cytologie byly podrobeny analýze western blot k měření hladin proteinů AQP5, MUC5AC a CFTR. Primární protilátky proti AQP5 (1:1000; ab92320, Abcam, Cambridge, Spojené království), MUC5AC (1:1000; ab198294, Abcam, Cambridge, Spojené království), CFTR (1:1000; MAB3482, Sigma-Aldrich, Missouri, USA), a p-aktin (1:10 000, č. 5125; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Otisková cytologie z levých očí, které zůstaly neléčené, byly použity jako kontroly. Původní snímky tak, jak byly uloženy během experimentu, jsou uvedeny na obrázku S1–S4 jako doplňkové soubory. Uložili jsme pouze obrazy proteinových pásů, které nás zajímaly, a obrazy blotů plné délky nebyly prezentovány.

Rastrovací elektronová mikroskopie

Po expozici po dobu 30 minut pro skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) a imunohistochemii byli králíci usmrceni pomocí komůrky s CO2 v celkové anestezii. Tkáně rohovky a spojivky byly po usmrcení jemně vyříznuty a byly prefixovány ve 2% glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru. Vzorky byly poté postfixovány po dobu 2 hodin v 1% kyselině osminové rozpuštěné ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem pro SEM. Poté byly rohovkové a spojivkové tkáně ošetřeny v odstupňované sérii ethanolu a t-butylalkoholu, vysušeny v lyofilizační sušičce (ES-2030; Hitachi, Tokio, Japonsko) a potaženy platinou pomocí iontového potahovače (IB-5 Eiko, Ibaraki, Japonsko). Vzhled epiteliálního povrchu rohovky a spojivky byl pozorován pomocí pole emise-SEM (S-4700; Hitachi)54. Procento ztráty buněk jsme definovali jako poměr ztráty buněk, který ukazuje odlupování nebo morfologickou změnu epiteliálních buněk k celkovému počtu epiteliálních buněk v každých čtyřech reprezentativních digitálních snímcích ze SEM, abychom kvantifikovali ztrátu epiteliálních buněk. Nejprve byla vypočtena celková plocha každého reprezentativního snímku pomocí „nastaveného měřítka“ založeného na známé vzdálenosti od SEM pomocí ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/; ve veřejné doméně poskytuje National Institutes of Zdraví, Bethesda, MD, USA). Za druhé, plocha každé rohovkové a spojivkové epiteliální buňky byla vypočtena z „nástroje pro výběr polygonu“. Za třetí, počet celkových epiteliálních buněk v každém reprezentativním snímku byl vypočten jako celková plocha každého reprezentativního snímku dělená plochou každé epiteliální buňky. Za čtvrté, počet úbytků buněk, který ukazuje odlupování epiteliálních buněk nebo morfologické změny, byl vypočítán pomocí „multi-point tool“ (obr. 4C,F). Nakonec bylo procento ztráty buněk vypočteno jako poměr ztráty buněk k celkovému počtu epiteliálních buněk v reprezentativních snímcích.

imunohistochemie

Přední segment každé oční bulvy byl chirurgicky odstraněn a fixován v 10% neutrálním pufrovaném formalínu a poté byl zalit do parafínu. Tkáně zalité v parafínu byly nařezány na 4μm řezy pomocí mikrotomu (Leica RM 2255; Leica, Bannockburn, IL, USA) a řezy tkání byly umístěny na mikroskopická sklíčka. Po deparafinizaci tkáňových řezů xylenem byly tkáňové řezy ponořeny do odstupňované série ethanolu a fosfátem pufrovaného sainu. Sériové řezy byly použity pro imunohistochemii CD31 (jako vaskulární endoteliální marker) a LYVE-1 (jako lymfatický endoteliální marker). Primární protilátky byly komerčně získány pro CD31 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornie) a LYVE-1 (1:100; Abcam Inc, Cambridge, Massachusetts). Pro sekundární detekci na bázi protilátek byla použita králičí specifická HRP/DAB (ABC) detekční IHC souprava (ab64261; Abcam) podle pokynů výrobce. Tkáňové řezy byly pozorovány pod světelným mikroskopem při 400násobném zvětšení a digitální snímky byly pořízeny mikroskopem Olympus BX51 a kamerou DP72 (Olympus Optical Co., Ltd., Tokio, Japonsko). Buňky pozitivní na CD31 byly stanoveny analýzou čtyř zorných polí na spojivkové biopsii a výsledky jsou uvedeny jako buňky na čtvereční milimetr. Lymfatický prostor obklopený LYVE-1 pozitivními buňkami (%) byl definován jako procento celkové plochy obklopené LYVE-1 pozitivními buňkami na celkovou pozorovanou plochu. Průměrný počet CD31-pozitivních buněk a lymfatický prostor obklopený LYVE-1-pozitivními buňkami (%) byly porovnány mezi expozičním modelovým okem a kontrolním okem.

Statistické analýzy

Statistické analýzy byly provedeny pomocí Mann‒Whitneyho U testu a Wilcoxonova testu se znaménkem v SPSS verze 20.0 (IBM SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Hodnoty jsou vyjádřeny jako medián a mezikvartilní rozsah. P< 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

Leave a Reply

Your email address will not be published.