Lactobacillus plantarum S9 zmírňuje lipidový profil, inzulínovou rezistenci a zánět u potkanů ​​s metabolickým syndromem vyvolaným dietou s vysokým obsahem tuku

Zdraví samci krys Sprague-Dawley (SD) (tělesná hmotnost, 220–240 g; n = 30) byli zakoupeni od Changchun Yisi Experimental Animal Technology Co., Ltd. (Changchun, Jilin). Před zahájením experimentu byly krysy krmeny adaptivně po dobu jednoho týdne za podmínek bez specifických patogenů (SPF) (cyklus 12/12 h světlo/tma) při regulovatelné teplotě (22 ± 1 °C) a vlhkosti (50 ± 1 %). a všechny krysy měly volný přístup k pitné vodě a potravě. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku zvířat při Jilin Academy of Agricultural Sciences (číslo schválení: SCXK2020-0001, Jilin, Čína).

Po jednom týdnu adaptace bylo 30 potkanů ​​náhodně rozděleno do tří skupin (n = 10 na skupinu): kontrolní skupina, skupina HFD a skupina HFD + S9. Krysy v kontrolní skupině krmené normální stravou obsahující 10 % tuku, zatímco skupina HFD a skupina HFD + S9 byly krmeny HFD obsahujícím 60 % tuku po dobu 8 týdnů40. Poté byly skupině HFD + S9 orálně podány 2 ml L. plantarum S9 a kontrolní skupině a skupině HFD byla podávána stejná dávka normálního fyziologického roztoku (jednou denně po dobu 6 týdnů). Nutriční složení stravy je uvedeno v tabulce 1. Každý týden byla zaznamenávána tělesná hmotnost a hladina glukózy v krvi krys v každé skupině. Po podání byly všechny krysy nalačno po dobu 12 hodin a anestetizovány intraperitoneální injekcí 5% pentobarbitalu sodného a vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí a sérum bylo získáno po centrifugaci při 4000 °C.G po dobu 10 minut při 4 °C. Potom byly krysy usmrceny cervikálním vytěsněním a bylo odebráno sérum a játra. Kromě toho byla část jater umístěna do 10% paraformaldehydu pro patologické zbarvení a zbývající jaterní tkáň byla bleskově zmražena v tekutém dusíku a uložena při -80 °C pro další analýzu41.

Tabulka 1 Nutriční složení běžné stravy a diety s vysokým obsahem tuků.

Stanovení souvisejících parametrů

Konečná hmotnost a délka krys byly zaznamenány 1 den před utracením, hmotnostní přírůstek každé skupiny byl vypočten podle definovaného vzorce [final weight (g) − initial body weight (g)]a Leeův index byl vypočten pomocí následujícího vzorce: Leeův index = třetí odmocnina konečné hmotnosti (g)/nasoanální délka (cm). Když byli potkani utraceni, játra byla okamžitě vyjmuta, byla zaznamenána hmotnost jater a jaterní index byl vypočítán pomocí následujícího vzorce: Jaterní index = (hmotnost jater/konečná tělesná hmotnost) × 100. Tělesná hmotnost a délka těla z krys v každé skupině byly zprůměrovány.

Analýza biochemických parametrů séra

V souladu s protokoly výrobců byly pomocí soupravy detekovány hladiny inzulinu, celkového cholesterolu (TC), TG, cholesterolu s vysokou hustotou lipoproteinů (HDL-C) a cholesterolu s lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL-C) v séru. zakoupené od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína) a obsah lipopolysacharidu (LPS), tumor nekrotizujícího faktoru-α (TNF-α), aspartátaminotransferázy (AST) a alaninaminotransferázy (ALT) byl stanoven pomocí soupravy ELISA (Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína). Hladina glukózy v krvi nalačno u potkanů ​​byla proto měřena pomocí aktivního glukometru ACCU-CHEK (Roche Diabetes Care GmbH, Mannheim, Německo) a indexu hodnocení inzulinové rezistence podle modelu homeostázy (HOMA-IR) a procenta funkce beta buněk ( Index HOMA-B) byl vypočten následovně: HOMA-IR = glykémie nalačno (mmol/l) × koncentrace inzulínu nalačno (mU/l)/22,5; HOMA-B = 20 × koncentrace inzulínu nalačno (mIU/l)/[fasting blood glucose (mmol/L) − 3.5].

Histologická analýza

Podle předchozí studie42byla jaterní tkáň fixována v 10% neutrálním paraformaldehydu (pH = 7,0), poté zalita do parafínu a byly připraveny 4μm řezy zalité v parafínu a umístěny na čistá skleněná mikroskopická sklíčka pro barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) a olej -červené O barvení. Poté byly snímky vizuálně analyzovány pomocí optického mikroskopu (Eclipse E100; Nikon, Tokio, Japonsko) a patologické změny jater v každé skupině byly pozorovány pomocí softwaru Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Western blot analýza

Celkový protein z krysích jater byl extrahován soupravou RIPA (ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Čína) podle metody Wang et al.43a jaterní extrakt byl centrifugován při 10 000 °CG po dobu 10 minut při 4 °C a odděleny pro získání proteinového extraktu. Poté byl obsah proteinu v supernatantu detekován pomocí BCA kitu (Wanleibio Co., Ltd., Shenyang, Čína), upravený na jednotnou koncentraci, plně smíchaný s roztokem pufru [60 mM Tris–HCl, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), and 2% β-mercaptoethanol, pH = 7.2]a denaturuje se 10 minut ve vroucí vodě. Poté byly proteinové vzorky separovány elektroforézou na 10% SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a přeneseny na polyvinylidenfluoridové (PVDF) membrány. Vzorky proteinů byly uzavřeny fyziologickým roztokem pufrovaným Tris s 0,05% roztokem Tween-20 (TBST), obsahujícím 3% hovězí sérový albumin (BSA) při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Nakonec byla provedena inkubace s králičím anti-TLR4 (1: 1000, bs-20379R, Bioss, Čína), králičí anti-p38 (1:1000, bs-0637R, Bioss, Čína), králičí anti-p-p38 (Thr180, 1:1000, bs-5476R, Bioss, Čína) králičí anti-IκBα (1:1500, bs-1287R, Bioss, Čína), králičí anti-p-IκBα (Ser 36, 1:1000, bs-18129R, Bioss, Čína), králičí anti-NFκB p65 (1: 1500, bsm-52305R, Bioss, Čína), králičí anti-p-p65 (Ser 281, 1:1500, bs-17502R, Bioss, Čína) a králičí anti-p-aktin (1:1000, bs-0061R, Bioss, Čína) při teplotě 4 °C po dobu 12 hodin, po které následovala inkubace s sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP) při teplotě 37 °C po dobu 60 minut. pomocí Image Quant LAS 4000 (Fuji Film, Tokio, Japonsko) (doplňkové obrázky).

Statistická analýza

Všechny experimentální výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Software SPSS 20.0 (IBM, Armonk, NY, USA) byl použit k analýze variací mezi skupinami pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA), po níž následoval Tukeyho post-hoc test. P< 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

Etická prohlášení

Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny a řízeny Výborem pro péči o zvířata Jilin Academy of Agricultural Sciences (číslo schválení: SCXK2020-0001).

Schválení IACUC

Všechny studie na zvířatech (včetně postupu eutanazie potkanů) byly provedeny podle pokynů AAALAC a IACUC.

ARRIVE pokyny

Všechny výzkumné metody obsažené v rukopisu jsou prováděny v souladu s požadavky ARRIVE.

Leave a Reply

Your email address will not be published.